¿Qué querés hacer?

Usá un coeficiente de absorción conocido o despejá cualquiera de las cuatro magnitudes.

Datos de la muestra

Elegí qué calcular y reemplazá los valores de ejemplo por tus datos.

¿Qué querés calcular?

A = \varepsilon_{\lambda}\,l\,c

Coeficiente de absorción molarελL·mol⁻¹·cm⁻¹

Usá el coeficiente correspondiente a la longitud de onda de medición.

Camino ópticol

Concentración molarc

Absorbancia

0.622A

Absorbancia y transmitancia

Absorbancia: 0.622A
Transmitancia: 0.2388
Transmitancia porcentual: 23.88%

La luz al atravesar la muestra

A mayor absorbancia, menor fracción de luz transmitida.

Luz transmitida23.88 %

De la luz incidente

Esquema ilustrativo; el color no representa el espectro de la muestra.

Fundamentos y Explicación

Absorbancia y transmitancia

El instrumento compara la potencia incidente $P_0$ con la transmitida $P$ . La transmitancia es su cociente y la absorbancia decádica aplica un logaritmo negativo:

T=\frac{P}{P_0}\qquad A=-\log_{10}(T)\qquad T=10^{-A}

$A$ y $T$ son adimensionales. La transmitancia porcentual es $\%T=100\,T$ : por ejemplo, $T=0{,}25$ equivale a 25 %. El logaritmo convierte la atenuación ideal en una relación lineal con el camino óptico.

Ley de Beer–Lambert y unidades

A una longitud de onda fija, la absorbancia es proporcional a la concentración y al camino óptico. La concentración molar y la másica requieren coeficientes con unidades compatibles:

A=\varepsilon_{\lambda}\,l\,c\qquad A=a^{*}_{\lambda}\,l\,\rho

$\varepsilon_\lambda$ : L·mol⁻¹·cm⁻¹, con $c$ en mol/L.
$a^*_{\lambda}$ : L·g⁻¹·cm⁻¹, con $\rho$ en g/L.
Con estos coeficientes, $l$ se expresa en cm. Los coeficientes dependen de la especie absorbente y de la longitud de onda $\lambda$ .

Por ejemplo, con $\varepsilon_\lambda=6220\;\mathrm{L\,mol^{-1}\,cm^{-1}}$ , camino óptico de 1 cm y $c=100\;\mu\mathrm{M}=10^{-4}\;\mathrm{mol/L}$ , se obtiene $A=0{,}622$ y una transmitancia aproximada de 23,88 %.

Supuestos del modelo ideal

Radiación con banda espectral suficientemente estrecha.
Medio homogéneo y no dispersante, con camino óptico conocido.
Especie absorbente estable y sin interacciones que cambien el coeficiente.
Respuesta instrumental lineal y blanco tratado de manera apropiada.

Para especies independientes, las contribuciones pueden ser aditivas, $A_{total}=\sum_i A_i$ . Para distinguir los componentes de una mezcla se necesitan mediciones y un modelo adicionales.

Causas de desviación

La luz parásita comprime absorbancias altas; una banda espectral ancha mezcla coeficientes distintos. La turbidez añade dispersión, y los equilibrios químicos, la asociación o cambios de pH pueden alterar la especie absorbente. Por eso no existe un intervalo universal de absorbancia que garantice linealidad para todos los instrumentos y métodos.

Calibración, interpolación y dilución

Los estándares se ajustan por mínimos cuadrados ordinarios con intercepto libre. Estándares y muestra deben compartir longitud de onda, camino óptico y tratamiento del blanco. La concentración se estima a partir de la absorbancia y se corrige por dilución:

A=m\,c+b\qquad \hat c=\frac{A_s-b}{m}\qquad c_0=\hat c\,FD

$m$ es la pendiente, $b$ el intercepto y $A_s$ la absorbancia de la muestra. Las concentraciones usan la misma unidad que los estándares; la cuantificación requiere $m>0$ .

El factor de dilución $FD$ es la razón entre el volumen final y el de la alícuota en una dilución simple. Llevar 1 mL de muestra a 10 mL de volumen final da $FD=10$ . $\hat c$ corresponde a la alícuota medida y $c_0$ a la muestra original.

La interpolación ocurre sólo cuando $\hat c$ queda entre el mínimo y el máximo de los estándares. Fuera de ese dominio, la extrapolación prolonga matemáticamente la recta pero suma incertidumbre no caracterizada.

Residuos, R² e intercepto

Los residuos $e_i=A_i-\hat A_i$ son las diferencias entre absorbancias medidas y predichas. Permiten examinar curvatura, cambios en la dispersión y puntos apartados del patrón general. Un R² alto no valida por sí solo la linealidad, los efectos de la matriz, el blanco ni la precisión.

Si el intervalo de confianza del 95 % del intercepto no contiene cero, puede haber una contribución del blanco o de la matriz. El ajuste por sí solo no identifica la causa.

Límites de detección y cuantificación

El límite de detección (LOD) se refiere a la menor concentración detectable; el límite de cuantificación (LOQ), a la menor cuantificable con precisión y exactitud adecuadas. Con desviación estándar residual $s_{y/x}$ y pendiente $m>0$ :

LOD_{est}=3{,}3\frac{s_{y/x}}{m}\qquad LOQ_{est}=10\frac{s_{y/x}}{m}

Estas estimaciones dependen del intervalo y del diseño de la calibración. Su confirmación requiere muestras de concentración conocida próximas a los límites y evidencia de precisión y exactitud adecuadas; el ajuste de una recta por sí solo no demuestra ese desempeño.

Alcance y referencias

OD600 depende principalmente de dispersión. En ácidos nucleicos, A260 puede usarse para estimar concentración con factores y correcciones apropiados; A260/A280 es un indicador de pureza. Ese cociente por sí solo no determina la concentración.

Espectrofotometría UV-Vis (Beer–Lambert)

Datos de la muestra

Absorbancia

La luz al atravesar la muestra

Fundamentos y Explicación

Absorbancia y transmitancia

Ley de Beer–Lambert y unidades

Supuestos del modelo ideal

Causas de desviación

Calibración, interpolación y dilución

Residuos, R² e intercepto

Límites de detección y cuantificación

Alcance y referencias

Absorbancia y transmitancia

Ley de Beer–Lambert y unidades

Supuestos del modelo ideal

Causas de desviación

Calibración, interpolación y dilución

Residuos, R² e intercepto

Límites de detección y cuantificación

Alcance y referencias