Absorbancia y transmitancia
El instrumento compara la potencia incidente P0 con la transmitida P. La transmitancia es su cociente y la absorbancia decádica aplica un logaritmo negativo:
T=P0PA=−log10(T)T=10−A A y T son adimensionales. La transmitancia porcentual es %T=100T: por ejemplo, T=0,25 equivale a 25 %. El logaritmo convierte la atenuación ideal en una relación lineal con el camino óptico.
En la práctica P0 es la lectura del blanco o de la referencia, no la potencia que sale de la fuente. Por eso una absorbancia ligeramente negativa es posible: indica que la muestra transmite algo más que el blanco, por ruido o por su corrección.
Ley de Beer–Lambert y unidades
A una longitud de onda fija, la absorbancia es proporcional a la concentración y al camino óptico. La concentración molar y la másica requieren coeficientes con unidades compatibles:
A=ελlcA=aλ∗lρ - ελ: L·mol⁻¹·cm⁻¹, con c en mol/L.
- aλ∗: L·g⁻¹·cm⁻¹, con ρ en g/L.
- Con estos coeficientes, l se expresa en cm. Los coeficientes dependen de la especie absorbente y de la longitud de onda λ.
Por ejemplo, con ελ=6220Lmol−1cm−1, camino óptico de 1 cm y c=100μM=10−4mol/L, se obtiene A=0,622 y una transmitancia aproximada de 23,88 %.
Supuestos del modelo ideal
- Radiación con banda espectral suficientemente estrecha.
- Medio homogéneo y no dispersante, con camino óptico conocido.
- Especie absorbente estable y sin interacciones que cambien el coeficiente.
- Respuesta instrumental lineal y blanco tratado de manera apropiada.
Para especies independientes, las contribuciones pueden ser aditivas,Atotal=∑iAi. Para distinguir los componentes de una mezcla se necesitan mediciones y un modelo adicionales.
Causas de desviación
La luz parásita comprime absorbancias altas; una banda espectral ancha mezcla coeficientes distintos. La turbidez añade dispersión, y los equilibrios químicos, la asociación o cambios de pH pueden alterar la especie absorbente. Por eso no existe un intervalo universal de absorbancia que garantice linealidad para todos los instrumentos y métodos.
Calibración, interpolación y dilución
Los estándares se ajustan por mínimos cuadrados ordinarios con intercepto libre. Estándares y muestra deben compartir longitud de onda, camino óptico y tratamiento del blanco. La concentración se estima a partir de la absorbancia y se corrige por dilución:
A=mc+bc^=mAs−bc0=c^FD m es la pendiente, b el intercepto y As la absorbancia de la muestra. Las concentraciones usan la misma unidad que los estándares; la cuantificación requiere m>0.
Comparar esta recta con A=ελlc identifica la pendiente: m=ελl, con b=0 en el caso ideal. Por eso el camino óptico común de los estándares permite obtener ελ a partir de la pendiente, y un intercepto distinto de cero señala una contribución ajena al analito.
El factor de dilución FD es la razón entre el volumen final y el de la alícuota en una dilución simple. Llevar 1 mL de muestra a 10 mL de volumen final da FD=10. c^ corresponde a la alícuota medida y c0 a la muestra original.
La interpolación ocurre sólo cuando c^ queda entre el mínimo y el máximo de los estándares. Fuera de ese dominio, la extrapolación prolonga matemáticamente la recta pero suma incertidumbre no caracterizada. Si As queda por debajo de b, la inversión devuelve un valor negativo, que no representa una concentración: apunta a una muestra por debajo del intervalo calibrado o a un problema de blanco o de línea base.
Residuos, R² e intercepto
Los residuos ei=Ai−A^i son las diferencias entre absorbancias medidas y predichas. Permiten examinar curvatura, cambios en la dispersión y puntos apartados del patrón general. Un R² alto no valida por sí solo la linealidad, los efectos de la matriz, el blanco ni la precisión.
Si el intervalo de confianza del 95 % del intercepto no contiene cero, puede haber una contribución del blanco o de la matriz. El ajuste por sí solo no identifica la causa.
Límites de detección y cuantificación
El límite de detección (LOD) se refiere a la menor concentración detectable; el límite de cuantificación (LOQ), a la menor cuantificable con precisión y exactitud adecuadas. Con desviación estándar residual sy/x y pendiente m>0:
LODest=3,3msy/xLOQest=10msy/x Estas estimaciones dependen del intervalo y del diseño de la calibración. Su confirmación requiere muestras de concentración conocida próximas a los límites y evidencia de precisión y exactitud adecuadas; el ajuste de una recta por sí solo no demuestra ese desempeño.
Alcance y referencias
OD600 depende principalmente de dispersión. En ácidos nucleicos, A260 puede usarse para estimar concentración con factores y correcciones apropiados; A260/A280 es un indicador de pureza. Ese cociente por sí solo no determina la concentración.