Temperatura de Fusión de Primers (Tm)

Modelo Nearest-Neighbor (SantaLucia 1998) con corrección de sal de Owczarzy · T_m = ΔH / (ΔS + R·ln(C_T/4))

Secuencia

Ejemplos:

Secuencia del primer (5′ → 3′)

Acepta A, C, G, T y códigos degenerados IUPAC (R, Y, N…); el resto se ignora.

Longitud: 20 nt · G+C: 11

Condiciones de reacción

Conjunto de parámetros

Concentración de oligo

Concentración total de hebra (C_T).

12000

Sodio / monovalentes

Na⁺ y K⁺ del buffer.

01000

Magnesio

Mg²⁺ total de la reacción.

010

dNTPs

Quelan al Mg²⁺ en relación 1:1.

Resultados

Temperatura de fusión (Tm)

59.67

°C

Annealing sugerida

54.67

°C

Regla práctica: Ta ≈ Tm − 5 °C.

Termodinámica

ΔG°₃₇: -25.61 kcal/mol
ΔH: -160.4 kcal/mol
ΔS: -434.6 cal/(K·mol)
ΔG del extremo 3′: -5.069 kcal/mol

Composición

Contenido G+C: 55 %
Longitud: 20 nt
Autocomplementaria: No

Curva de fusión

Fracción de hebra desnaturalizada vs. temperatura (modelo idealizado de dos estados)

Fundamentos y Explicación

¿Qué es la Tm y por qué importa?

La temperatura de fusión (Tm) es la temperatura a la que la mitad de las moléculas de un dúplex de ADN están apareadas y la otra mitad se han separado en hebras simples. En una PCR, los primers deben unirse a su molde durante el paso de annealing: si la temperatura es muy alta respecto a la Tm, el primer no se ancla; si es muy baja, se une en sitios incorrectos (mispriming). Por eso conocer la Tm de cada primer es el primer paso para diseñar una reacción específica y eficiente.

La temperatura de annealing que se programa en el termociclador suele fijarse unos grados por debajo de la Tm. Una regla práctica habitual es:

T_a \approx T_m - 5\,°C

El modelo de vecinos más cercanos (Nearest-Neighbor)

La estabilidad de un dúplex no depende solo de cuántos pares G·C y A·T hay, sino de cómo se apilan las bases vecinas. El modelo de vecinos más cercanos asigna valores de entalpía (ΔH) y entropía (ΔS) a cada uno de los 10 pasos dinucleotídicos únicos (AA/TT, AT, TA, CA/TG, …) y los suma a lo largo de la secuencia, añadiendo penalizaciones de iniciación en cada extremo:

\Delta H = \sum_i \Delta H_{vecino,i} + \Delta H_{ini}

\Delta S = \sum_i \Delta S_{vecino,i} + \Delta S_{ini}

Con la entalpía y la entropía totales, la Tm de un oligo no autocomplementario se obtiene de la termodinámica de la transición de dos estados:

T_m = \dfrac{\Delta H}{\Delta S + R\,\ln\!\left(\dfrac{C_T}{4}\right)}

donde R es la constante de los gases (1,987 cal·K⁻¹·mol⁻¹) y C_T la concentración total de hebra. El factor 4 corresponde a hebras no autocomplementarias en igual concentración; si la secuencia es un palíndromo (autocomplementaria), se usa 1 y se añade una corrección de simetría a la entropía. (El resultado de esta ecuación está en Kelvin; en la calculadora se muestra convertido a °C.)

Referencia: SantaLucia (1998), PNAS — parámetros unificados de vecinos más cercanos

La curva de fusión

Si seguimos la fracción de hebra desnaturalizada a medida que sube la temperatura, obtenemos una curva sigmoidea cuyo punto medio (fracción = 0,5) es exactamente la Tm. Bajo el modelo de dos estados, esa fracción se describe con una ecuación tipo van 't Hoff (con las temperaturas T y Tm en Kelvin):

f(T) = \dfrac{1}{1 + \exp\!\left[\dfrac{\Delta H}{R}\left(\dfrac{1}{T_m} - \dfrac{1}{T}\right)\right]}

La curva que dibuja esta herramienta es idealizada: trata la transición como si fuera unimolecular para mostrar de forma clara la pendiente y el centro en la Tm. La hibridación real entre primer y molde es bimolecular y su forma exacta depende de la concentración, pero el punto medio sigue coincidiendo con la Tm calculada.

El efecto de las sales

Los parámetros de vecinos más cercanos están calibrados a 1 M de NaCl, pero una PCR trabaja con mucha menos sal. Los cationes apantallan la repulsión entre los esqueletos de fosfato cargados negativamente: a más sal, más estable el dúplex y mayor la Tm. Esta calculadora corrige la Tm con el modelo de Owczarzy, que distingue el aporte de los cationes monovalentes (Na⁺, K⁺) y del Mg²⁺ divalente, eligiendo el régimen dominante a partir del cociente R = √[Mg²⁺] / [monovalentes].

Un detalle clave de la PCR: los dNTPs quelan el Mg²⁺ en relación 1:1, así que lo que estabiliza el dúplex es el magnesio libre:

[Mg^{2+}]_{libre} = [Mg^{2+}]_{total} - [dNTP]

Referencias: Owczarzy et al. (2004), Biochemistry · Owczarzy et al. (2008), Biochemistry

Diseñar un buen primer

Más allá de la Tm, la calculadora revisa varios criterios prácticos de diseño:

•Longitud de 18–24 nt: suficiente para ser específico sin encarecer la síntesis.
•Contenido G+C de 40–60 %: equilibra estabilidad y especificidad.
•Broche GC (GC-clamp): 1–2 bases G/C en el extremo 3′ favorecen el anclaje; demasiadas aumentan el mispriming.
•Estabilidad del extremo 3′ (ΔG de los últimos nucleótidos): si es muy negativa, el primer puede extender en sitios incorrectos.
•Evitar repeticiones de ≥ 4 bases iguales, que provocan deslizamiento de la polimerasa.

Bases degeneradas (IUPAC). Muchos primers reales —de virología o del gen 16S— incluyen posiciones ambiguas (R = A/G, Y = C/T, N = cualquiera…) para cubrir variantes de la plantilla. La calculadora expande cada código en todas sus combinaciones concretas y reporta la Tm (y ΔG, ΔH, ΔS, %GC) como un rango entre la variante más débil y la más estable. En ese caso la Ta se calcula sobre la Tm mínima: si fuera más alta, las variantes menos estables no hibridarían y se perderían del pool.

Esta herramienta estima propiedades termodinámicas de una hebra; no analiza horquillas ni dímeros de primers (estructuras secundarias), que requieren un cálculo de plegamiento aparte.

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